从识别到信号放大：一款高特异性荧光生物传感器

近日，济南大学发布科技成果转化公示，学校通过协议定价方式，拟将“一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器”相关专利转让给山东鑫纪元企业服务有限公司，该专利的发明人为王玉。

图片来自济南大学官网

该技术是济南大学研发的基于CRISPR‑Cas12a的外泌体荧光生物传感技术，通过双适配体特异性识别肿瘤外泌体表面PD‑L1与EpCAM蛋白，触发杂交链式反应与滚环扩增，激活Cas12a反式切割荧光报告探针产生可定量信号，实现肿瘤外泌体快速、高灵敏、高特异性定量检测，检测限低至7.59×10²particles/mL，可用于癌症早期液体活检与相关试剂盒开发。

肿瘤外泌体作为癌症早期液体活检的核心生物标志物，在肿瘤诊断、预后评估与疗效监测中具备重要临床价值，伴随精准医疗发展，临床与产业化对其快速、特异、高灵敏定量检测的需求持续攀升。但现有外泌体检测技术存在多重核心痛点，严重制约其在临床诊断与产业化中的落地应用。

传统外泌体检测方法面临特异性缺失的关键瓶颈：外泌体表面标志物存在肿瘤来源与非肿瘤来源标记重叠问题，单一靶标检测无法区分正常细胞与肿瘤细胞分泌的外泌体，易出现假阳性结果；多数技术仅针对单一蛋白标志物识别，无法精准锁定肿瘤特异性外泌体，难以满足癌症早期诊断的高可靠性要求。

在检测性能上，现有技术普遍存在灵敏性不足、操作复杂的双重短板：常规方法检测限偏高，无法捕捉体液中低丰度的早期肿瘤外泌体，易漏检早期病变；部分高灵敏方法依赖大型仪器、操作步骤繁琐、检测耗时长，且需专业人员操作，不适合临床现场快速检测；同时，信号放大效率有限，难以实现痕量外泌体的精准定量，无法匹配临床对微量样本检测的需求。

从产业化与临床普及来看，现有技术还存在实用性与标准化缺陷：多数检测体系构建复杂、试剂稳定性差、成本高昂，难以实现批量生产与临床推广；检测流程多为非均相反应，反应速度慢、重复性差，缺乏可标准化、易操作、适配临床场景的检测方案。

此外，现有技术难以兼顾高特异性与高灵敏性，无法解决“精准识别肿瘤外泌体”与“痕量定量检测”的核心矛盾，导致外泌体液体活检陷入“难区分、测不准、慢且贵”的应用困境，临床亟需一种高特异、高灵敏、快速简便、可产业化的外泌体检测技术，破解肿瘤外泌体精准检测的全链条难题。

针对肿瘤外泌体检测长期存在的特异性不足、灵敏度偏低、操作繁琐、难以产业化等行业痛点，济南大学王玉、黄加栋等团队成功研发基于CRISPR‑Cas12a系统的荧光生物传感器。该技术以双适配体特异性识别与HCR‑RCA‑Cas12a级联信号放大为核心创新，构建“识别—触发—扩增—报告”一体化检测体系，突破传统方法“分不清、测不准、慢且繁”的瓶颈，为肿瘤液体活检与外泌体精准定量提供全新解决方案。

在识别特异性方面，技术实现源头创新，彻底解决标记重叠难题。区别于单一靶标检测易出现假阳性的缺陷，本技术采用PD‑L1Apt与EpCAMApt双适配体构建三链体Aptamer，仅当两者同时结合肿瘤外泌体表面对应蛋白时，才释放Trigger链启动检测，实现肿瘤来源外泌体精准锁定，从源头区分肿瘤与非肿瘤外泌体，大幅降低交叉干扰，特异性达到行业领先水平。

在灵敏度与信号放大方面，通过多级反应协同，实现痕量样本超灵敏检测。Trigger链触发杂交链式反应（HCR），配合phi29酶介导滚环扩增（RCA），使Trigger链循环复用，信号呈指数级放大；再结合Cas12a反式切割活性，高效剪切荧光报告探针，实现微弱信号的可视化与定量读取。经实验验证，传感器检测限低至7.59×10²particles/mL，可精准捕捉体液中极低丰度的早期肿瘤外泌体，满足早期诊断对超高灵敏度的核心需求。

在检测效率与操作便捷性方面，均相反应体系带来颠覆性体验。全程在均一液相中完成，无需复杂分离纯化、无需大型精密仪器，37℃恒温两步孵育即可完成检测，流程简化、耗时大幅缩短；试剂配方明确、条件可控，操作门槛低、重复性好，突破传统技术步骤繁琐、依赖专业人员的局限，适配临床现场快速检测与批量样本筛查场景。

在产业化与临床适配性方面，具备规模化落地的显著优势。传感器组分明确、制备工艺标准化，可批量合成适配体、发夹链、crRNA等核心试剂，稳定性强、易于组装成试剂盒；配套缓冲体系、酶试剂均为商业化通用原料，生产成本可控、便于量产。同时，检测结果定量准确、线性关系良好，完全契合临床诊断对数据可靠性的要求，可直接应用于肿瘤早筛、预后监测、疗效评估等场景，兼具科研价值与产业化前景，推动外泌体液体活检从实验室走向临床普及。

外泌体作为肿瘤液体活检核心标志物，临床与科研需求快速增长，推动全球企业与机构围绕分离富集、蛋白/核酸检测、仪器/试剂盒展开布局，形成传统免疫/理化方法与CRISPR分子传感两大技术路线，当前以科研试剂与临床前检测为主，商业化试剂盒集中于泛标志物定量与单癌种筛查。

赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）的Total Exosome Isolation试剂盒、Dynabeads免疫磁珠分离、NanoSight粒径计数系统、CD9/CD63/CD81流式检测方案。全球市占领先，标准化科研级试剂盒成熟，支持细胞上清/血清/尿液样本，以分离富集与通用标记检测为主。

深圳汇芯生物医疗科技有限公司的泌芯安 ® 尿液外泌体前列腺癌基因检测试剂盒。无创居家采样，仅需15mL晨尿；依托自主EXODUS®系统高效富集高纯度外泌体；联合检测多个前列腺癌特异性RNA标志物；基于中国人群位点与专属算法模型输出风险评分；在PSA4~20ng/ml“灰区”对高级别前列腺癌的预测性能优于PSA。目前已进入临床研究，聚焦特定癌种，基于基因标志物，流程先富集再检测。

摩熵医药（Pharnex Cloud）旗下人源细胞外囊泡化学发光检测试剂盒（Total human EV CLIA ELISA kit）。采用夹心化学发光 ELISA原理，以抗 CD9/CD63/CD81 通用四跨膜蛋白抗体进行捕获与检测，可直接对血清、血浆、细胞上清等样本进行总外囊泡定量；标曲范围0.16–10 μg/mL，检测限0.10 μg/mL，板内精密度CV＜10%、板间CV＜15%，准确度在75%–125%区间，有效降低 NTA 粒度计数的干扰，操作标准化、适配 96 孔板高通量筛查，仅限科研使用。目前科研级已上市，通过抗体识别通用泛抗原，可实现总外泌体快速定量。