共价探针平行跳跃绘制变构细胞周期蛋白E-CDK2位点-动脉网

An allosteric cyclin E-CDK2 site mapped by paralog hopping with covalent probes

Nature 等信源发布 2024-09-18 19:28

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AbstractMore than half of the ~20,000 protein-encoding human genes have paralogs. Chemical proteomics has uncovered many electrophile-sensitive cysteines that are exclusive to subsets of paralogous proteins. Here we explore whether such covalent compound–cysteine interactions can be used to discover ligandable pockets in paralogs lacking the cysteine.

摘要在编码人类基因的约20000种蛋白质中，有一半以上具有旁系同源物。化学蛋白质组学发现了许多亲电子敏感的半胱氨酸，这些半胱氨酸是旁系同源蛋白亚群所独有的。在这里，我们探讨这种共价化合物-半胱氨酸相互作用是否可用于发现缺乏半胱氨酸的旁系同源物中的可连接口袋。

Leveraging the covalent ligandability of C109 in the cyclin CCNE2, we substituted the corresponding residue in paralog CCNE1 to cysteine (N112C) and found through activity-based protein profiling that this mutant reacts stereoselectively and site-specifically with tryptoline acrylamides. We then converted the tryptoline acrylamide–CCNE1-N112C interaction into in vitro NanoBRET (bioluminescence resonance energy transfer) and in cellulo activity-based protein profiling assays capable of identifying compounds that reversibly inhibit both the N112C mutant and wild-type CCNE1:CDK2 (cyclin-dependent kinase 2) complexes.

利用细胞周期蛋白CCNE2中C109的共价连接性，我们将旁系同源CCNE1中的相应残基替换为半胱氨酸（N112C），并通过基于活性的蛋白质分析发现该突变体与胰蛋白酶丙烯酰胺发生立体选择性和位点特异性反应。然后，我们将胰蛋白酶-丙烯酰胺-CCNE1-N112C相互作用转化为体外NanoBRET（生物发光共振能量转移）和基于纤维素活性的蛋白质分析测定，能够鉴定可逆抑制N112C突变体和野生型CCNE1的化合物：CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶2）复合物。

X-ray crystallography revealed a cryptic allosteric pocket at the CCNE1:CDK2 interface adjacent to N112 that binds the reversible inhibitors. Our findings, thus, show how electrophile–cysteine interactions mapped by chemical proteomics can extend the understanding of protein ligandability beyond covalent chemistry..

X射线晶体学显示，在与N112相邻的CCNE1:CDK2界面处有一个隐秘的变构口袋，该口袋与可逆抑制剂结合。因此，我们的发现表明，化学蛋白质组学绘制的亲电-半胱氨酸相互作用如何将对蛋白质可配体性的理解扩展到共价化学之外。。

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Fig. 1: Covalent stereoprobes targeting CCNE2 and a CCNE1-N112C mutant.Fig. 2: NanoBRET assay for measuring stereoprobe interactions with CCNE1-N112C.Fig. 3: Characterizing engagement of the CCNE1:CDK2 complex by 2,6-diazaspiro[3.4]octane inhibitors.Fig. 4: Crystal structure of an I-198–CCNE1:CDK2 complex.Fig.

图1：靶向CCNE2和CCNE1-N112C突变体的共价立体探针。。图3：表征CCNE1:CDK2复合物与2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷抑制剂的结合。图4:I-198–CCNE1:CDK2复合物的晶体结构。图。

5: Comparison of functional effects of 2,6-diazaspiro[3.4]octane and tryptoline acrylamide ligands on CCNE1-N112C:CDK2 complexes.Fig. 6: Cellular engagement and activity of 2,6-diazaspiro[3.4]octane inhibitors of CCNE1:CDK2 complexes..

5：比较2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷和色氨酸丙烯酰胺配体对CCNE1-N112C:CDK2复合物的功能作用。图6:CCNE1:CDK2复合物的2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷抑制剂的细胞参与和活性。。

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数据可用性

Proteomic data are available from ProteomeXchange with identifiers PXD048328 and PXD053077. The atomic coordinates and structure factors were deposited to the PDB (www.pdb.org) under accession codes 8VQ3 (I-198–CCNE1:CDK2 structure) and 8VQ4 (I-125A–CCNE1:CKD2 structure)). Coding sequences of the DNA constructs used in this study are provided in Supplementary Table 1.

蛋白质组学数据可从ProteomeXchange获得，标识符为PXD048328和PXD053077。。补充表1提供了本研究中使用的DNA构建体的编码序列。

Source data are provided with this paper..

本文提供了源数据。。

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Thorarensen，A。等人设计了Janus激酶3（JAK3）特异性抑制剂1-（（2S，5R）-5-（（7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基）氨基）-2-甲基哌啶-1-基）丙-2-烯-1-酮（PF-06651600），允许在人体中询问JAK3信号传导。J、医学化学。601971-1993（2017）。文章。

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Rostovtsev，V.V.，Green，L.G.，Fokin，V.V。和Sharpless，K.B。逐步Huisgen环加成过程：铜（I）催化的叠氮化物和末端炔烃的区域选择性“连接”。。化学。国际英语。412596-2599（2002）。文章

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Tickle，I.J.等人，STARANISO（Global Phasing Ltd.，2018）。McCoy，A.J.等人，Phaser晶体学软件。J、应用。晶体学。40658-674（2007）。文章

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Liebschner，D.等人，《利用X射线、中子和电子测定大分子结构：Phenix的最新进展》。晶体学报D 75861-877（2019）。文章

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Emsley，P.，Lohkamp，B.，Scott，W.G。和Cowtan，K。Coot的特征和发展。晶体学报D 66486-501（2010）。文章

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Download referencesAcknowledgementsThis work was supported by the National Cancer Institute (R35 CA231991) and Pfizer. We thank Y.-A. He for purification of recombinant CCNE1:CDK2 complexes used for crystallography and R. A. Ferre for development of the CCNE1:CDK2 crystallization conditions.

下载参考文献致谢这项工作得到了美国国家癌症研究所（R35 CA231991）和辉瑞公司的支持。我们感谢Y.-A.He纯化用于晶体学的重组CCNE1:CDK2复合物，感谢R.A.Ferre开发CCNE1:CDK2结晶条件。

We thank T. J. Matthewson for preparing compound plates for the NanoBRET high-throughput screen. Use of the IMCA-CAT beamline 17-ID (or 17-BM) at the Advanced Photon Source was supported by the companies of the Industrial Macromolecular Crystallography Association through a contract with Hauptman-Woodward Medical Research Institute.

我们感谢T.J.Matthewson为NanoBRET高通量筛选制备复合板。通过与Hauptman Woodward医学研究所签订的合同，工业大分子晶体学协会的公司支持在高级光子源上使用IMCA-CAT光束线17-ID（或17-BM）。

This research used resources of the Advanced Photon Source, a US Department of Energy (DOE) Office of Science User Facility operated for the DOE Office of Science by Argonne National Laboratory under contract no. DE-AC02-06CH11357.Author informationAuthor notesSherry NiessenPresent address: Belharra Therapeutics, San Diego, CA, USAMatthew M.

这项研究使用了先进光子源的资源，这是美国能源部（DOE）科学办公室用户设施，由阿贡国家实验室根据合同号DE-AC02-06CH11357为DOE科学办公室运营。作者信息作者注释Sherry NiessenPresent地址：Belharra Therapeutics，San Diego，CA，USAMatthew M。

HaywardPresent address: Magnet Biomedicine, Boston, MA, USAAuthors and AffiliationsDepartment of Chemistry, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USAYuanjin Zhang, Zhonglin Liu, Sang Joon Won, Divya Bezwada, Bruno Melillo & Benjamin F. CravattMedicine Design, Pfizer Research and Development, Pfizer, Inc., La Jolla, CA, USAMarscha Hirschi, Oleg Brodsky, Eric Johnson, Asako Nagata & Al E.

Hayward目前地址：美国马萨诸塞州波士顿Magnet Biomedicine作者和附属机构加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所化学系张元金，刘中林，桑俊元，Divya Bezwada，Bruno Melillo＆Benjamin F.CravattMedicine Design，辉瑞研发，辉瑞公司，加利福尼亚州拉霍亚，USAMarscha Hirschi，Oleg Brodsky，Eric Johnson，Asako Nagata＆Al E。

StewartOncology Research and Development, Pfizer, Inc., La Jolla, CA, USAMatthew D. Petroski, Sherry Niessen, Todd VanArsdale & Andrew R. NagerDiscovery Sciences, Pfizer Research and Development, Pfizer, Inc., Cambridge, MA, USAJaimeen D. MajmudarDiscovery Sciences, Pfizer Research and Development, Pfizer, Inc., Groton, CT, USAAdam M.

StewartOncology Research and Development，辉瑞公司（Pfizer，Inc.），加利福尼亚州拉霍亚（La Jolla），美国马修（USAMATHEW D.Petroski），雪莉·尼森（Sherry Niessen），托德·瓦那斯代尔（Todd VanArsdale）和安德鲁·纳格尔迪斯科维尔（Andrew R.NagerDiscovery Sciences），辉瑞公司（Pfizer Research and Development），辉瑞公司（Pfizer，Inc.），马萨诸塞州剑桥（Cambridge），美国贾伊明（。

Gilbert & Matthew M. HaywardAuthorsYuanjin ZhangView author publicationsYou c.

Gilbert&Matthew M.HaywardAuthorsYuanjin ZhangView作者出版物You c。

PubMed Google ScholarZhonglin LiuView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarZhonglin LiuView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarMarscha HirschiView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarMarscha HirschiView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarOleg BrodskyView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarOleg BrodskyView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarEric JohnsonView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed谷歌学者JohnsonView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarSang Joon WonView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarSang Joon WonView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarAsako NagataView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarAsako NagataView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarDivya BezwadaView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarDivya BezwadaView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarMatthew D. PetroskiView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarMatthew D.PetroskiView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarJaimeen D. MajmudarView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarJaimeen D.MajmudarView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarSherry NiessenView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarSherry NiessenView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarTodd VanArsdaleView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarAdam M. GilbertView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarAdam M.GilbertView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarMatthew M. HaywardView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarMatthew M.HaywardView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarAl E. StewartView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarAl E.StewartView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarAndrew R. NagerView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarAndrew R.NagerView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarBruno MelilloView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarBruno MelilloView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarBenjamin F. CravattView author publicationsYou can also search for this author in

PubMed Google ScholarBenjamin F.CravattView作者出版物您也可以在

PubMed Google ScholarContributionsY.Z. and B.F.C. conceptualized the study and wrote the paper. Y.Z. designed and performed the gel-ABPP, NanoBRET, ADP-Glo, IP–MS and cell biology experiments. Y.Z. and D.B. designed and performed the protein-directed ABPP experiments. O.B. and S.J.W.

PubMed谷歌学术贡献。Z、 B.F.C.将研究概念化并撰写了论文。Y、。Y、 Z.和D.B.设计并进行了蛋白质导向的ABPP实验。O、 B.和S.J.W。

purified relevant CCNE1:CDK2 complexes. M.H. and E.J. led the efforts in resolving the I-125A-bound and I-198-bound CCNE1:CDK2 cocrystal structures. Z.L. and B.M. led the efforts in chemical synthesis. Y.Z., Z.L., M.H., O.B., E.J., A.N., D.B., M.D.P., J.D.M., S.N., T.V., A.M.G., M.M.H., A.E.S., A.R.N., B.M.

纯化的相关CCNE1:CDK2复合物。M、 H.和E.J.领导了解决I-125A结合和I-198结合CCNE1:CDK2共晶结构的努力。Z、 L.和B.M.领导了化学合成的努力。Y、 Z.，Z.L.，M.H.，O.B.，E.J.，A.N.，D.B.，M.D.P.，J.D.M.，S.N.，T.V.，A.M.G.，M.M.H.，A.E.S.，A.R.N.，B.M。

and B.F.C. contributed to data analysis and interpretation. A.N., M.D.P., J.D.M., S.N., T.V., A.M.G., M.M.H., A.E.S. and A.R.N. provided administrative, technical or material support. All authors edited and approved the paper. B.F.C. supervised the study.Corresponding authorCorrespondence to.

B.F.C.为数据分析和解释做出了贡献。A、 N.，M.D.P.，J.D.M.，S.N.，T.V.，A.M.G.，M.M.H.，A.E.S.和A.R.N.提供了行政，技术或物质支持。所有作者都编辑并批准了这篇论文。B、 F.C.监督了这项研究。对应作者对应。

Benjamin F. Cravatt.Ethics declarations

本杰明·F·克拉瓦特。道德宣言

Competing interests

相互竞争的利益

The authors declare no competing interests.

作者声明没有利益冲突。

Peer review

同行评审

Peer review information

同行评审信息

Nature Chemical Biology thanks Nathanael Gray, Matthew Robers and the other, anonymous reviewer(s) for their contribution to the peer review of this work.

自然化学生物学感谢Nathanel Gray，Matthew Robers和另一位匿名审稿人对这项工作的同行评审做出的贡献。

Additional informationPublisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.Extended dataExtended Data Fig. 1 Cancer Dependency Map data for the CCNE1 and CCNE2 genes.Cancer Dependency Map data for the CCNE1 and CCNE2 genes, indicating the number of human cancer cell lines showing gene effect scores < −1.0, reflecting strong dependency on the gene32.Source dataExtended Data Fig.

Additional informationPublisher的注释Springer Nature在已发布的地图和机构隶属关系中的管辖权主张方面保持中立。扩展数据扩展数据图1 CCNE1和CCNE2基因的癌症依赖图数据。CCNE1和CCNE2基因的癌症依赖性图谱数据，表明显示基因效应得分 <-1.0的人类癌细胞系的数量，反映了对基因32的强烈依赖性。

2 Gel-ABPP of a focused library of tryptoline acrylamides for reactivity with an N112C-CCNE1:CDK2 complex.a, Structures of alkyne-modified tryptoline acrylamides screened for reactivity with an N112C-CCNE1:CDK1 complex. b, Gel-ABPP data showing reactivity of alkyne-modified tryptoline acrylamides (5 µM, 1 h) with purified N112C-CCNE1:CDK2 or WT-CCNE1:CDK2 complexes (1 µM).

2胰高血糖素丙烯酰胺聚焦文库的凝胶ABPP与N112C-CCNE1:CDK2复合物的反应性。a，炔烃修饰的胰高血糖素丙烯酰胺的结构筛选与N112C-CCNE1:CDK1复合物的反应性。b、凝胶ABPP数据显示炔烃修饰的胰蛋白酶丙烯酰胺（5μM，1小时）与纯化的N112C-CCNE1:CDK2或WT-CCNE1:CDK2复合物（1μM）的反应性。

Gel-ABPP analysis was performed as described in Fig. 1d. Coomassie blue signals correspond to N112C- or WT-CCNE1. Red box marks profile of WX-02-520, which reacted with N112C-CCNE1 in a stereoselective (compared to enantiomer WX-02-521) and site-specific (compared to WT-CCNE1) manner. Data are from a single experiment.Source dataExtended Data Fig.

如图1d所述进行凝胶ABPP分析。考马斯蓝信号对应于N112C或WT-CCNE1。红色框标记了WX-02-520的图谱，该图谱以立体选择性（与对映体WX-02-521相比）和位点特异性（与WT-CCNE1相比）方式与N112C-CCNE1反应。数据来自单个实验。源数据扩展数据图。

3 N112C-CCNE1 and WT-CCNE2 show differential reactivity profiles with tryptoline acrylamides.a, Gel-ABPP data showing concentration-dependent, stereoselective blockade of WX-02-520 engagement of purified N112C-CCNE1 by WX-02-308 in comparison to enantiomer WX-02-326. Purified N112C-CCNE1:CDK2 complex (1 µM) was pre-treated with the indicated concentrations of WX-02-308 or WX-02-326 (2 h) followed by WX-02-520 (1 µM) and gel-ABPP analysis.

3 N112C-CCNE1和WT-CCNE2显示出与色氨酸丙烯酰胺的不同反应性曲线。a，凝胶ABPP数据显示WX-02-308对纯化的N112C-CCNE1的浓度依赖性立体选择性阻断与对映体WX-02-326相比。纯化的N112C-CCNE1:CDK2复合物（1μM）用指定浓度的WX-02-308或WX-02-326（2小时）预处理，然后用WX-02-520（1μM）和凝胶ABPP分析。

Data are from a single experiment representative of two independent experiments with similar results. b, Gel-ABPP data showing stereoselective engagement of WT-CCNE2, b.

数据来自代表两个独立实验的单个实验，结果相似。b、凝胶ABPP数据显示WT-CCNE2的立体选择性接合，b。

Nat Chem Biol (2024). https://doi.org/10.1038/s41589-024-01738-7Download citationReceived: 21 January 2024Accepted: 20 August 2024Published: 18 September 2024DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-024-01738-7Share this articleAnyone you share the following link with will be able to read this content:Get shareable linkSorry, a shareable link is not currently available for this article.Copy to clipboard.

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