专访山东肿瘤医院苗传望：构建小鼠食管癌细胞系NCCE2，正进一步探索靶向药物细胞模型

近年来，食管癌发病趋势严峻，但其具体发生机制尚未完全阐明，临床缺乏有效的治疗措施。

据悉，在全球范围内，食管癌的发病率和死亡率均排在前十位。在GLOBOCAN 2020发布的数据中显示，全球食管癌的新发病例数超过60万，死亡人数超过37万例，死亡率过半。

面对食管癌临床治疗的困境，山东肿瘤医院苗传望博士表示，目前人们对于食管癌的治疗研究还不成熟，主要是因为缺乏合适的细胞模型，尤其是小鼠来源的肿瘤细胞系。

因此，苗传望构建了一株小鼠来源的食管癌细胞系NCCE2，据悉，此次建立的模型对于食管癌研究来说，有着巨大的潜在应用，即可以使用NCCE2细胞系模型来探究食管癌的发病机制，并寻找治疗的新策略。

受“科创中国”第二届生物医学高价值专利项目评选活动的邀请，动脉橙果局有幸采访到苗传望博士，橙果局根据采访实录进行了整理和编辑，与大家一同了解NCCE2及其研究过程。

在过去的实验中，苗传望在其恩师林东昕院士的带领下,通过整合94例食管癌拷贝数扩增高表达数据,证明了鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV2是扩增高表达的癌基因。

苗传望在功能和机制两方面都说明了VAV2的癌症基因特征。首先在功能上,VAV2高表达与放射抵抗相关，大量的实验证明VAV2是潜在影响放疗抵抗的驱动基因；其次在机制上,VAV2影响放疗疗效可能是通过DNA损伤修复介导。

此外，苗传望又通过31例食管癌患者的病理组织及临床数据分析发现,VAV2可以作为放疗抵抗的生物标记物来预测食管癌患者的近期疗效。据了解，肿瘤组织中VAV2高表达的患者放疗疗效更差。

基于以上研究，苗传望在后续细胞系NCCE2的搭建上，首先就考虑这种缺失VAV2基因敲除的转基因小鼠模型。

实际上，在靶向基因编辑研究中，Cas9这项被冠以诺奖桂冠的技术已经十分成熟并广泛应用。

因此，苗传望在针对c57小鼠构建 VAV2基因的gRNA实验中，同样也使用了Cas9技术，并指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切DNA双链，又通过NHEJ(nonhomologous end joining)机制修复双链断裂缺口，在断口造成不同长度序列的删除或插入，从而通过移码实现VAV2基因的敲除。

苗传望向橙果局透露，VAV2基因成功敲除后，实验还没有结束。他还需要让小鼠大量繁殖，使它们成为VAV2缺失的转基因小鼠后，再为其构建食管癌模型，即小鼠自己的食管生长出癌细胞。

要达到这一目的，苗传望开始给小鼠饲喂致癌剂4NQO，诱导小鼠产生食管癌。具体来说，是将4NQO药液喂给6-8周VAV2缺失转基因小鼠，连用16周后停药，继续养小鼠12周后解剖小鼠食管查看成瘤情况。

图为4NQO诱导的小鼠食管癌的实物图

“我们要把小鼠的食管取下并将肿瘤培养出来是一件非常难的事，这是因为小鼠的食管很小，甚至比牙签还要细，同时它长出来的瘤子也很小。”苗传望解释道。

取出小鼠食管新生肿瘤后，苗传望通过特殊配制的培养基将其倒置放入细胞培养箱中，再挑选单克隆，继续稳定培养细胞数月，使细胞表型稳定，并和NCCG1(野生型的小鼠肿瘤细胞)对照实验，检测出细胞的VAV2表达水平。

由此，来源于小鼠的食管癌细胞系构建成功，苗传望将其命名为NCCE2。

目前来看，在基础研究领域，食管癌细胞系的应用还是以KYSE系列和TE系列为主。

作为舶来品，这两类细胞系在上个世纪被中国科学家从日本引入，并在国内大规模推广。到现在，国内科学家已经将它们视为食管癌研究的首要选择。事实上，这两类细胞系在使用过程中存在两大缺点：一个是丧失了一些原始肿瘤的特征，另一个是在很多实验室中存在被污染的风险。

与前两者比起，NCCE2的细胞特征更具优异性。

首先从增殖能力来看，苗传望通过使用CCK8试剂盒——一种高度灵敏的可以间接反映活细胞数量的试剂，进行检测并发现：NCCE2细胞培养板成肉眼可见的黄色，且根据酶标仪检测OD450波段信号值，和现有的食管癌细胞系CCK8增殖能力做比较，绘制出不同细胞增殖曲线。

图为NCCE2与市售细胞系的增殖能力比较图

通过比较图，我们看到相比于KYSE细胞系，NCCE2细胞系在48小时后，其生长能力与它们拉开差距，并逐渐明显。

其次是克隆形成能力，苗传望使细胞处于单细胞状态，并以细胞计数，而后使用6孔板，每孔加入2ml完全培养基，将细胞按照每孔相同的数量加入，在1824小时后，根据实验具体内容给予不同的处理，继续培养细胞1014天。

进行统计分析后发现，6孔板上面三个是每孔铺设500个细胞，下面三个是每孔铺设250个细胞，这说明了NCCE2具有平板克隆形成能力。

图为NCCE2的克隆形成实验的结果图

最后是细胞迁移能力，以Transwell小室为主要实验材料，来检验NCCE2细胞侵袭、迁移、趋化性能力。在实验过程中，苗传望将小室上层加入无血清培养基150μl，下室放入含血清的完全培养基500μl，使用显微镜观察并拍照，再用软件计算膜表面贴壁的肿瘤细胞后发现，肿瘤细胞会营养趋化迁移至下室膜上。

图为Transwell实验的显微镜下细胞形态图

“我的兴趣点在于培养更多可以解决临床问题的细胞模型。”这是苗传望内心的声音，从事临床工作的他常常看到病人处于困境中，例如靶向耐药、化疗耐药、免疫耐药等。

因此，在未来规划中，苗传望将细胞系建模工作放在最前面。在病人知情同意的情况下，获得他们的细胞，构建出与化疗相关、与免疫相关的细胞系，解决临床上更加实际的问题。

苗传望还告诉橙果局，除了NCCE2外，他还构建了人食管癌细胞系NCCE1和小鼠胃癌细胞系NCCG1，都可以直接应用于抗肿瘤药物筛选、新药研发等相关重要研究，并希望找到合适的公司进行转让。

那如何实现专利转让呢？苗传望认为主要有三点：一是政策与科研上的支持，减少科研人员的后顾之忧，让他们专心在研究工作中；第二点是专利申请，知识产权是成果保护的核心，也是推动转化的重要因素，包括后期利益分配的合理性；第三是技术推广，让更多的公司和投资人看到技术并了解技术。

除了关注转化工作外，他还正在构建一些靶向耐药的细胞模型并针对VAV2基因进一步探索，目前已经发现了与免疫耐药相关的靶点。

最后，当我们谈及到初衷之时，苗传望的一句“是医生，也是科学家”，让我想起了“有时治愈，常常帮助，总是安慰。”这句医学谚语。

诚然，作为医生，他更多的是安慰和帮助病人，但作为科学家，他又致力于去改变那个“有时”。

*参考文献：

苗传望.胃食管交界处癌中RICTOR和食管癌中VAV2的功能研究［D］．北京：北京医院，2022.

林东昕，吴晨，苗传望，刘伟玲，席奕轶，刘亚宸，林皑，仲策，张少森.一种VAV2基因缺失的肿瘤细胞系［P］.中国专利：ZL202110668444.2，2021.08.31.