听力损失影响全球超过4.5亿人，其中高达50%的病例具有遗传起源。尽管助听器和人工耳蜗等干预措施能够部分改善听力损失，但它们无法解决潜在的疾病根源。近年来，基因编辑技术为治疗单基因性耳聋带来了曙光，但现有递送方法的局限性一直制约着临床转化的进程。
11月12日，佛罗里达大学药学院Mei He副教授团队在《科学·转化医学》杂志上发表的一项研究为这一领域带来了突破性进展。研究团队开发了一种基于微流控液滴的细胞外囊泡电穿孔系统(μDES)，成功将基因编辑工具递送至小鼠耳蜗毛细胞，在遗传性进行性听力损失小鼠模型中实现了听力保护效果，且这一效果在注射后6个月仍可观察到。
（来源：Science Translational Medicine）
这项研究不仅为非病毒基因编辑递送平台提供了概念验证，更展现出广阔的临床转化前景。
研究团队开发的μDES系统代表了基因编辑递送技术的重大创新。该系统能够高效地将单链RNA引导的CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物(sgRNA:Cas9 RNP)加载到细胞外囊泡中。相比传统的高压脉冲电穿孔方法，μDES系统在性能上实现了显著提升，加载效率提高了10倍，而处理通量则提升超过1000倍。
这一技术平台的核心优势在于其独特的工作原理。μDES系统利用微流控技术生成包含细胞外囊泡和核糖核蛋白复合物的均匀微液滴，并通过直流控制的低电压(最高60伏特)实现瞬时膜透化，从而高效地将基因编辑工具封装入囊泡内。与传统方法使用的高电压相比，μDES仅需约30伏特的电压就能维持有效的加载效率，这大幅降低了焦耳热效应和高电压带来的风险。
研究团队在论文中强调，微流控液滴电穿孔充分利用了受限空间内高效的物质传输，最大化了细胞外囊泡的加载容量，从而在体外和体内都创造了最优的基因编辑效率。液滴的快速连续流动防止了细胞外囊泡与电极的直接接触，避免了对囊泡的热损伤，保留了其天然的完整性和稳定性。在紧凑的液滴空间内，均匀的电场可以被精确控制，这极大地提高了一致性和转染效率。
更重要的是，该系统在蛋白质和形态学层面都保持了细胞外囊泡的完整性。细胞外囊泡是细胞释放的纳米级、气泡状包裹物，细胞通过这些囊泡相互通讯。其膜由脂质双层组成，蛋白质组成与供体细胞相似，可以通过脉冲电击瞬时透化。与病毒载体相比，细胞外囊泡具有独特的优势：它们由天然生物材料制成，对人体无毒性风险，由于容易被细胞吸收，能够深入组织，从而产生更好的治疗效果。
为了验证μDES系统的有效性，研究团队选择了Myo7aWT/Sh1小鼠作为疾病模型。这一模型携带Myo7a基因突变，表现为常染色体显性遗传性进行性听力损失，可能模拟人类MYO7A相关的DFNA11型听力损失。
在人类中，MYO7A基因编码听觉和前庭毛细胞中的非常规肌球蛋白VIIA蛋白，该蛋白在感觉毛细胞的发育和信号转导中发挥关键作用。该基因突变导致39%至55%的Usher综合征最常见形式的病例，这种综合征与严重的先天性耳聋相关。此外，MYO7A突变还与不伴随其他症状的常染色体显性和隐性听力损失以及家族性年龄相关性听力损失有关。
研究团队在4周龄的Myo7aWT/Sh1小鼠中，通过后半规管注射装载了sgRNA：Cas9 RNP的细胞外囊泡。通过横截面和全贴片共聚焦成像，研究人员证实了核糖核蛋白复合物通过细胞外囊泡成功递送到耳蜗毛细胞。
实验结果令人鼓舞。与未治疗耳和仅注射空白细胞外囊泡的小鼠相比，接受RNP-EV治疗的小鼠表现出多项积极变化，首先，突变的Myo7aSh1信使RNA表达水平显著降低，表明基因编辑成功实现;其次，通过听觉脑干反应(ABR)测量显示，治疗小鼠的听力功能得到了保护。
特别值得注意的是，研究团队观察到，接受细胞外囊泡治疗的小鼠实现了听力功能恢复，其效果几乎可与同龄正常听力的野生型小鼠相媲美。这一结果证明了通过基因编辑在体内有效保护听力损失的可行性，而且这种听力保护效果在注射后6个月仍可观察到，显示出治疗的持久性。
此外，研究团队还评估了治疗的安全性。结果显示，μDES产生的装载sgRNA：Cas9 RNP的细胞外囊泡表现出低脱靶编辑率，且根据听觉脑干反应检测，也没有耳毒性的证据。这些数据为该平台的安全性提供了重要支持。
这项研究的重要意义，首先体现在它克服了现有基因治疗方法的关键限制。目前，腺相关病毒(AAV)载体是基因治疗中最常用的递送工具，但其有限的包装容量(约4.7kb)严重限制了其在递送大型基因编辑系统方面的应用。特别是对于CRISPR-Cas9系统，Cas9蛋白编码序列本身就接近或超过AAV的包装容量，这使得将完整的基因编辑系统装入AAV载体极具挑战性。
细胞外囊泡平台提供了一个优雅的解决方案。作为天然的细胞间通讯载体，细胞外囊泡具有更大的装载容量，能够容纳完整的核糖核蛋白复合物。Mei He教授强调：“细胞外囊泡具有大容量的装载能力，能够实现更有效的治疗剂量，并且由天然生物材料制成，因此对人体没有毒性风险。”
其次，该研究团队将核糖核蛋白复合物而非DNA或RNA封装进细胞外囊泡，研究人员在论文中指出：“基于Cas9的基因编辑技术进行基因组编辑是纠正常染色体显性听力损失潜在遗传缺陷的一种有前景的方法。将sgRNA：Cas9 RNP封装在细胞外囊泡中，提供了一种针对内耳的瞬时但可能持久的精确基因组修饰方法。”这种瞬时作用可以降低长期表达基因编辑工具可能带来的脱靶风险。
第三，μDES平台的可定制性为个性化治疗开辟了可能。研究人员表示：“该平台可以将特定突变的基因编辑机制装载到细胞外囊泡中，从而能够根据患者的异质性突变背景定制治疗，这为克服当前基因治疗中的一些挑战提供了潜力。”这意味着该技术可以根据不同患者的特定基因突变进行调整，实现精准医疗。
这项研究的另一个突出价值在于其显著的临床转化潜力。与许多仅在实验室规模运作的系统不同，μDES平台天然具有可扩展性，并与良好生产规范(GMP)管线兼容。Mei He教授强调：“与其他专为实验室建造的小规模系统不同，我们的平台天然可扩展，并与良好生产规范管线兼容，这将使向人类临床试验和大规模生产的转化更加快速和容易。”
在美国国立卫生研究院130万美元资助的支持下，该团队计划在约三年内启动人体临床试验。这一时间框架相对较短，反映了该技术平台在工艺开发和质量控制方面的优势。高通量和可扩展性使得该系统能够满足临床级生产的需求，而低电压操作和对细胞外囊泡完整性的保护则有助于确保产品的一致性和稳定性。
图：Mei He副教授与其团队成员Xiaoshu Pan博士（来源：佛罗里达大学药学院）
此外，该技术平台的应用潜力远不止于听力损失治疗。研究团队开发的细胞外囊泡平台可以与多种基因编辑材料配对，用于治疗其他遗传性疾病。Mei He教授表示：“我们的技术可以应用于任何适合基因治疗的疾病，包括乳腺癌和肌肉衰退。这是对我们研究领域的一个高度令人兴奋的突破性贡献。”这种通用性大大拓展了该技术的应用范围和商业价值。
研究人员认为，这些结果为该平台作为基因编辑递送以及可能的其他货物递送至内耳特定应用奠定了概念验证基础。对于进行性非综合征性听力损失这一迄今缺乏有效治疗手段的疾病领域，这项技术提供了真正针对疾病根源的治疗选择。
这项发表在《科学·转化医学》上的研究展示了细胞外囊泡介导的基因编辑在治疗遗传性听力损失方面的巨大潜力。通过开发高效、安全且可扩展的μDES技术平台，研究团队不仅在小鼠模型中实现了显著的听力保护效果，更为基因治疗领域提供了一个克服现有递送方法局限性的创新解决方案。
从技术创新角度看，μDES系统在加载效率、处理通量、安全性和可扩展性方面的显著优势，使其在众多基因编辑递送方法中脱颖而出。
从临床价值角度看，该技术为数以百万计的遗传性听力损失患者带来了治愈的希望，并为其他遗传性疾病的治疗提供了新的工具。从转化医学角度看，该平台与GMP标准的兼容性和相对较短的临床转化时间线，使得这项实验室创新有望在不久的将来惠及患者。
随着技术的进一步优化和临床试验的推进，基于细胞外囊泡的基因编辑递送平台有望在精准医疗时代发挥越来越重要的作用，为人类对抗遗传性疾病开辟新的路径。
渝公网安备 50011202502165号
